05月23 公共數(shù)據(jù)揭示小麥Bax抑制劑-1蛋白（BI-1）與水通道蛋白TaPIP1相互作用增強(qiáng)擬南芥抗病性
隨著高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，測(cè)序數(shù)據(jù)量呈現(xiàn)指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，各類公共數(shù)據(jù)規(guī)模日益龐大，公共數(shù)據(jù)整合分析已逐漸成為很多研究中的一項(xiàng)重要分析手段。利用公共數(shù)據(jù)一方面可以降低研究成本，另一方面可以補(bǔ)充一些受限于研究者研究背景與技術(shù)水平而難以自主檢測(cè)的關(guān)鍵數(shù)據(jù)。截至目前，高通量測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)SRA數(shù)據(jù)庫(kù)已收錄超過(guò)10Pbase的NGS數(shù)據(jù)，但是由于公共數(shù)據(jù)整合分析過(guò)程中下載、存儲(chǔ)和分析各個(gè)環(huán)節(jié)都存在較高的技術(shù)門檻，導(dǎo)致研究者對(duì)公共數(shù)據(jù)的利用不充分。對(duì)于這些問(wèn)題百邁客已經(jīng)提供了非常成熟的解決方案，一鍵式導(dǎo)入即可完成數(shù)據(jù)的下載和存儲(chǔ)，輔以平臺(tái)上多達(dá)25個(gè)高度集成化的分析流程，可視化界面助您輕松搞定分析難題。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬有志老師課題組的徐兆師研究員等研究人員在百邁客云平臺(tái)結(jié)合公共數(shù)據(jù)完成擬南芥抗病性研究，成果于2018年1月22日發(fā)表在《Frontiers in Plant Science》上，影響因子4.298。
摘要
Bax抑制劑-1（BI-1）是真核生物中進(jìn)化保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），定位細(xì)胞死亡抑制因子。 BI-1抑制生物和非生物脅迫的能力在擬南芥中得到了充分研究，而小麥中BI-1的功能在很大程度上是未知的。在這項(xiàng)研究中，將禾谷鐮刀菌（Fg）處理的小麥進(jìn)行RNA-seq分析，然后分離小麥BI-1基因TaBI-1.1。通過(guò)水楊酸（SA）處理誘導(dǎo)TaBI-1.1表達(dá)，并通過(guò)脫落酸（ABA）處理誘導(dǎo)TaBI-1.1的下調(diào)?；讦?葡糖醛酸糖苷酶（GUS）染色，TaBI-1.1在成熟葉和根中表達(dá)，但不在下胚軸或幼葉中表達(dá)。 TaBI-1.1在擬南芥中的組成型表達(dá)增強(qiáng)了其對(duì)丁香假單胞菌病毒（Pst）DC3000感染的抗性并誘導(dǎo)SA相關(guān)基因表達(dá)。此外，TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥顯示出由高濃度SA引起的損害的減輕，并降低了對(duì)ABA的敏感性。與表型一致，35S :: TaBI-1.1和Col-0植物的RNA-seq分析顯示TaBI-1.1參與生物脅迫。這些結(jié)果表明，TaBI-1.1正向調(diào)節(jié)SA信號(hào)并在對(duì)生物脅迫的響應(yīng)中起重要作用。此外，TaBI-1.1與水通道蛋白TaPIP1相互作用，并且它們都定位于ER膜（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜）。此外，研究人員證明了SA處理后TaPIP1上調(diào)，并且TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥增強(qiáng)了對(duì)Pst DC3000感染的抗性。由此表明，在ER膜上TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用可能發(fā)生在對(duì)SA信號(hào)和防御反應(yīng)的響應(yīng)中。
材料和方法
使用擬南芥Columbia-0（Col-0）作為TaBI-1.1過(guò)表達(dá)的背景， 突變體atbi1-2從擬南芥生物資源中心（ABRC）獲得。 從栽培的小麥品種小白麥擴(kuò)增TaBI-1.1和TaPIP1的cDNA， 將PCR產(chǎn)物克隆到pLB載體中，使用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列同一性比較。
RNA-Seq Analysis
收集來(lái)自4周齡Col-0和轉(zhuǎn)基因系35S :: TaBI-1.1的葉片用于RNA-seq分析，使用HiSeq 2500平臺(tái)測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)與TAIR 10擬南芥參考基因組比對(duì)。使用TopHat和Cufflink軟件包進(jìn)行mRNAseq數(shù)據(jù)分析以及DEG的鑒定和分析。通過(guò)GOseq軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO富集分析。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路進(jìn)行KEGG富集分析，尋找差異表達(dá)基因的富集通路。在百邁客云平臺(tái)（BMKCloud）完成小麥Fg處理的RNA-seq數(shù)據(jù)下載和分析， SRA數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)：PRJNA289545）。
其他實(shí)驗(yàn)：1.qRT-PCR分析；2.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在脅迫處理下的應(yīng)答及性狀評(píng)價(jià)；3.β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）活性測(cè)定；4.細(xì)菌接種和細(xì)菌生長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)；5.酵母雙雜交系統(tǒng)；6.Pull-Down assay（免疫沉淀法）；7.亞細(xì)胞定位測(cè)定；8.ELISA Assay（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）
分析結(jié)果
1.通過(guò)qRT-PCR和β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）染色確定TaBI-1.1的表達(dá)模式
研究人員分析了來(lái)自Fg處理的小麥RNA-seq數(shù)據(jù)，以研究植物防御信號(hào)通路。從RNA-seq分析中分離出前10個(gè)差異表達(dá)基因。在這10個(gè)基因中鑒定了兩個(gè)小麥BI-1基因：TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980。 TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980在之前的研究中被命名為TaBI-1。在小麥Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中僅篩選出三種BI-1基因：TaBI-1，TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6AS_TGACv1_488014_AA1573990。在兩個(gè)差異表達(dá)的BI-1基因中， TaBI-1.1的差異最大。根據(jù)氨基酸比對(duì)，TaBI-1.1與TaBI-1同一性達(dá)到99.19％。與對(duì)照相比，F(xiàn)g處理對(duì)TaBI-1.1的表達(dá)水平上調(diào)24倍。許多關(guān)于AtBI-1的研究已經(jīng)證實(shí)AtBI-1在植物中對(duì)生物和非生物脅迫的抗性中起關(guān)鍵作用。 TaBI-1.1蛋白的序列與AtBI-1有69.88％的同一性，表明該序列在BI-1家族中基本保守。使用qRT-PCR監(jiān)測(cè)TaBI-1.1的表達(dá)模式以確定TaBI-1.1在生物和非生物脅迫中可能的作用。TaBI-1.1的表達(dá)在響應(yīng)SA處理時(shí)顯著上調(diào)，在響應(yīng)ABA處理時(shí)下調(diào)。 SA處理48小時(shí)后TaBI-1.1表達(dá)達(dá)到8倍高峰（圖1A）。 響應(yīng)ABA處理的下調(diào)水平在8小時(shí)達(dá)到初始水平的約1/5（圖1C）。 響應(yīng)NaCl處理，表達(dá)水平在4小時(shí)后下降，在2小時(shí)稍微增加并且在8小時(shí)后回到其初始水平（圖1B）。
研究者創(chuàng)建了含有1.7kb TaBI-1.1啟動(dòng)子并生成轉(zhuǎn)基因擬南芥的PBI :: GUS融合構(gòu)建體，以研究TaBI-1.1的空間表達(dá)模式。使用GUS染色測(cè)定組織GUS活性。在成熟葉和根中有TaBI-1.1表達(dá)，但在下胚軸和幼葉中觀察不到（圖1D）。還檢測(cè)了各種小麥組織中的TaBI-1.1表達(dá)水平，包括根，莖，葉和小穗，結(jié)果表明TaBI-1.1的表達(dá)在這些小麥組織中普遍存在，而且在葉中最高，在小穗中最低（圖1I）。在SA和NaCl處理之后，成熟葉中的表達(dá)與對(duì)照相比增加，并且SA處理的表達(dá)更高。當(dāng)SA和NaCl處理時(shí)，在下胚軸中也檢測(cè)到表達(dá)（圖1E，F(xiàn)）。在ABA處理的植物的葉子中檢測(cè)到較弱的表達(dá)（圖1G）。通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步證實(shí)GUS表達(dá)水平（圖1H）。以上結(jié)果表明，TaBI-1.1在各種脅迫下均有表達(dá)。
圖1. 通過(guò)qRT-PCR和GUS染色評(píng)估TaBI-1.1的相應(yīng)表達(dá)模式
2.TaBI-1.1的表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥對(duì)Pst DC3000感染的抗性
經(jīng)過(guò)Fg和SA處理后表達(dá)上調(diào)，假設(shè)TaBI-1.1可能參與生物脅迫反應(yīng)。研究人員在擬南芥中異位表達(dá)TaBI-1.1，在花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子的控制下驗(yàn)證這一假設(shè)。選擇兩個(gè)TaBI-1.1表達(dá)水平相對(duì)較高的純合株系3和7（35S :: TaBI-1.1＃1和35S :: TaBI-1.1＃2）用于進(jìn)一步分析（圖2A）。將atbi1-2，Col-0和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的四周齡葉子進(jìn)行Pst DC3000感染或10mM MgCl 2處理（模擬物）。在模擬實(shí)驗(yàn)中，在用10mM MgCl 2處理3天后，在atbi1-2，Col-0和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的葉中沒(méi)有觀察到明顯差異（圖2B）。在用600nm（OD600）0.002的光密度接種Pst DC3000，3天后在這些葉中檢測(cè)到疾病癥狀。 atbi1-2突變體表現(xiàn)出的癥狀較嚴(yán)重，因?yàn)閹缀跛械娜~片都表現(xiàn)出嚴(yán)重的萎黃和壞死，而兩種轉(zhuǎn)基因品系表現(xiàn)出比atbi1-2和Col-0更輕微的疾病癥狀。轉(zhuǎn)基因植物的一小部分葉子是綠色的，沒(méi)有表現(xiàn)出萎黃和壞死。 Col-0葉中疾病癥狀的程度介于atbi1-2和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系之間（圖2C）。在接種Pst DC3000或10mM MgCl 2（模擬物）后24小時(shí)監(jiān)測(cè)SA水平。在模擬組中，在35S :: TaBI-1.1＃1中觀察到最高的SA水平，且顯著高于Col-0。在Pst DC3000處理下，與Col-0相比，在兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中檢測(cè)到顯著較高的SA水平，并且在四種基因型中35S :: TaBI-1.1＃1含有最高的SA水平。 Col-0和atbi1-2之間的差異也達(dá)到了顯著水平（圖2D）。在0和3dpi時(shí)測(cè)量 atbi1-2，Col-0和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的葉片中的細(xì)菌滴度。在初始接種量（0dpi）中，在四種基因型中沒(méi)有觀察到致病細(xì)菌生長(zhǎng)的顯著差異。在3dpi時(shí)，兩種轉(zhuǎn)基因品系的細(xì)菌滴度明顯低于Col-0，Col-0的細(xì)菌滴度也明顯低于atbi1-2，表明兩種轉(zhuǎn)基因品系對(duì)致病細(xì)菌的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，并且atbi1-2比Col-0更容易感染病原菌（圖2E）?；趦蓚€(gè)轉(zhuǎn)基因株系中較高水平的35S :: TaBI-1.1＃1，使用35S :: TaBI-1.1＃1來(lái)進(jìn)一步檢測(cè)PR1的表達(dá)。高SA水平誘導(dǎo)PR基因的表達(dá)以增強(qiáng)植物對(duì)病原體攻擊的抗性。 PR1表達(dá)的增加或許可以解釋對(duì)Pst感染抵抗力的增強(qiáng)（圖2F）。
圖2. TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)Pst DC3000的抗性增強(qiáng)
3.TaBI-1.1正向調(diào)節(jié)的SA相關(guān)基因表達(dá)
PR基因表達(dá)與SA積累和系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）有關(guān)。進(jìn)一步檢測(cè)了常規(guī)條件下生長(zhǎng)2周齡Col-0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1＃1幼苗中SA相關(guān)基因的表達(dá)。與Col-0和atbi1-2相比，在35S :: TaBI-1.1中觀察到PR1，PR5，ICS1和EDS1有顯著高表達(dá)水平。 然而，在這些基因表達(dá)水平中Col-0和atbi1-2之間沒(méi)有檢測(cè)到顯著差異（圖3）。 與Col-0相比，35S :: TaBI-1.1中PR1和PR5的表達(dá)水平分別增加了約11倍和9倍。 PR2，ICS1和EDS1表達(dá)的倍數(shù)變化低于PR1和PR5表達(dá)的變化（圖3）。因此，TaBI-1.1上調(diào)PR1，PR2，PR5，ICS1和EDS1基因的表達(dá)，表明 TaBI-1.1在SA信號(hào)傳導(dǎo)中起正向調(diào)節(jié)作用。
圖3. 通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)正常條件下生長(zhǎng)的atbi1-2，Col-0和35S :: TaB1-1.1 2周齡幼苗中5個(gè)SA相關(guān)基因的表達(dá)水平。
4.TaBI-1.1降低了SA和ABA的敏感性
將Col-0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1的4日齡幼苗置于含有不同濃度SA，NaCl和ABA的MS培養(yǎng)基中，以研究Col- 0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在苗期響應(yīng)SA和其他脅迫處理的不同表型。 13天后監(jiān)測(cè)到形態(tài)學(xué)變化。在沒(méi)有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上（MS0），在任何兩種基因型的Col-0，atbi1-2和兩種35S :: TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因品系之間沒(méi)有觀察到顯著差異的根長(zhǎng)，側(cè)根或鮮重（圖4A，E-G）。在補(bǔ)充有30μMSA的MS培養(yǎng)基上，atbi1-2與Col-0在鮮重，根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)量上顯示出較大的差異（圖4H-J）。 35S :: TaBI-1.1＃2的側(cè)根數(shù)也與Col-0的側(cè)根數(shù)顯著不同（圖4J）。在含有30μMSA的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的植物中，Col-0的異常生長(zhǎng)程度介于atbi1-2和35S :: TaBI-1.1之間（圖4H-J）。高濃度SA會(huì)增加H2O2的積累并導(dǎo)致氧化損傷。當(dāng)置于含有50μMSA的MS培養(yǎng)基上時(shí)，幼苗顯示更明顯的生長(zhǎng)畸形。這些結(jié)果顯示，在SA濃度較高的情況下，幼苗遭受更嚴(yán)重的SA脅迫。用高濃度SA處理的葉子比用MS0培養(yǎng)基處理的葉子綠色淺，黃色淡和葉子?。▓D4B）。在含有50μMSA的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的35S :: TaB1-1.1＃1的根長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于Col-0（圖4K）。35S :: TaBI-1.1＃1的鮮重和側(cè)根數(shù)與Col-0相比顯著增加（圖4L，M）。因此，SA不僅影響葉子的大小和顏色，而且影響根長(zhǎng)，鮮重和側(cè)根數(shù)。
此外，研究人員檢查了在含有NaCl和ABA的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的幼苗的表型。 在含有100和120mM NaCl的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的植物之間沒(méi)有觀察到顯著差異（圖4C，N-S）。在用20μMABA處理后，atbi1-2的畸形程度比 Col-0和35S :: TaBI-1.1更明顯（圖4D）。 根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，atbi1-2與Col-0相比在根長(zhǎng)，鮮重和側(cè)根數(shù)上顯示出顯著差異，表明atbi1-2對(duì)ABA更敏感（圖4T-V）。 然而， 30μMABA處理中未觀察到根長(zhǎng)，鮮重或側(cè)根數(shù)的明顯差異（圖4W-Y）。 因此，TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)高濃度SA表現(xiàn)出降低的敏感性，并且atbi1-2突變體對(duì)ABA表現(xiàn)出增加的敏感性。
圖4. 在含有SA，NaCl或ABA的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的atbi1-2，Col-0和35S :: TaB-1.1幼苗根長(zhǎng)，鮮重和側(cè)根數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析。
研究者進(jìn)一步研究了TaBI-1.1在發(fā)芽過(guò)程中對(duì)ABA的敏感性。 在不同濃度的ABA的培養(yǎng)基上每12小時(shí)記錄發(fā)芽種子的百分比。在MS0培養(yǎng)基中，Col-0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥植物顯示相似的發(fā)芽率（圖5A）。 含有0.5μMABA的培養(yǎng)基中，兩種轉(zhuǎn)基因株系萌發(fā)顯著快于Col-0和atbi1-2（圖5B）。 在含有1μMABA的培養(yǎng)基上觀察不到顯著差異（圖5C）。 在含有2μMABA的培養(yǎng)基上，Col-0和兩種轉(zhuǎn)基因品系也比atbi1-2稍快地萌發(fā)（圖5D）。 以上結(jié)果表明，TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA的敏感性較低。
圖5. TaBI-1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥在萌發(fā)過(guò)程中對(duì)ABA的敏感性降低。
5.擬南芥RNA-Seq分析中TaBI-1.1的表達(dá)
研究人員對(duì)35S :: TaBI-1.1＃1和Col-0植物進(jìn)行了RNA-seq分析，以更好地理解TaBI-1.1功能。鑒定出48個(gè)上調(diào)基因和58個(gè)下調(diào)基因并做了一個(gè)熱圖。使用GO分析將差異表達(dá)的基因功能分類。富集了30多個(gè)GO terms，如圖6所示。對(duì)于上調(diào)的基因，富集的GO terms主要集中在抗生物脅迫，細(xì)胞免疫應(yīng)答和SA合成與代謝相關(guān)的生物過(guò)程上。前10個(gè)關(guān)鍵的Go terms分別是防御反應(yīng)、對(duì)外部刺激的反應(yīng)、對(duì)生物刺激的反應(yīng)、對(duì)外部生物刺激的反應(yīng)、多生物體過(guò)程、對(duì)另一個(gè)生物體的反應(yīng)、對(duì)另一個(gè)生物體的防御反應(yīng)、對(duì)壓力的反應(yīng)、單一生物體代謝過(guò)程和對(duì)化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)（圖6A）。對(duì)于下調(diào)的基因，富集的GO terms集中在細(xì)胞組分上，并且前三項(xiàng)是細(xì)胞組分，膜和細(xì)胞周圍（圖6B）。選擇七個(gè)上調(diào)基因和三個(gè)下調(diào)基因進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq分析一致。
圖6. 使用RNA-seq分析GO terms在35S :: TaBI-1.1和Col-0之間差異表達(dá)的基因的富集
KEGG富集分析差異表達(dá)基因被呈現(xiàn)為散點(diǎn)圖。 使用富集因子、q值和通路中富集的基因數(shù)量來(lái)測(cè)量富集程度。 富集因子越高表示富集程度越高。觀察到上調(diào)基因富集了20多個(gè)KEGG通路。上調(diào)基因的前20個(gè)富集通路中，其中光合作用是最明顯的富集途徑（圖7A）。 光合作用的富集因子達(dá)到0.09，而q值大約為0。相反，下調(diào)基因的KEGG富集通路并不明顯，只有6個(gè)富集因子較低的通路被鑒定出來(lái)（圖7B）。因此，TaBI-1.1參與對(duì)生物脅迫的應(yīng)答并主要通過(guò)基因上調(diào)表達(dá)來(lái)執(zhí)行其防御功能。
圖7. 35S :: TaBI-1.1和Col-0差異表達(dá)基因的KEGG富集分析
6.TaBI-1.1與TaPIP1相互作用并在ER膜上與TaPIP1共定位
將TaBI-1.1置于PGBKT7（BD）載體中，用作誘導(dǎo)蛋白在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中篩選小麥cDNA文庫(kù)，以進(jìn)一步探索TaBI-1.1調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的細(xì)胞機(jī)制。 結(jié)果，鑒定出一個(gè)候選的相互作用物質(zhì)，水通道蛋白TaPIP1。 使用酵母雙雜交和pull-down測(cè)定來(lái)確定TaBI-1.1和TaPIP1之間在體內(nèi)和體外的相互作用。將融合TaBI-1.1（BD-TaBI-1.1）的BD載體和融合TaPIP1（AD-TaPIP1）的pGADT7（AD）載體轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中。只有用BD-TaBI-1.1和AD-TaPIP1轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞能夠在缺乏Trp，Leu，His和Ade（SD / -Trp-Leu-Ade-His）的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)換TaBI-1.1和TaPIP1的融合載體產(chǎn)生相同的結(jié)果，表明TaBI-1.1與TaPIP1在酵母細(xì)胞中有相互作用（圖8A）。使用pull-down分析進(jìn)一步確認(rèn)相互作用（圖8B）。將TaBI-1.1克隆到pCold TM TF表達(dá)載體中在大腸桿菌中產(chǎn)生重組蛋白TF-His-TaBI-1.1。通過(guò)將序列克隆到pGEX-4T-1載體中，在大腸桿菌中成功產(chǎn)生了重組GST（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）-TaPIP1蛋白。使用抗His抗體的Western印跡所示，體外pull-down測(cè)定顯示TF-His-TaBI-1.1與GST-TaPIP1有物理互作（physically interacted）（圖8B）
AtBI-1定位于ER膜上，研究者在小麥原生質(zhì)體中檢測(cè)了TaBI-1.1-GFP和mRFP-HDEL的共定位以確定TaBI-1.1的亞細(xì)胞定位。GFP和mRFP熒光的重疊系數(shù) 是0.69，表明TaBI-1.1與ER膜上的HDEL共定位（圖8C）。 鑒于TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用，研究者還檢測(cè)到TaPIP1-GFP和mRFP-HDEL之間的共定位以及TaBI-1.1-GFP和TaPIP1-mRFP在小麥原生質(zhì)體中的共定位（圖8C）。 結(jié)果顯示TaBI-1.1和TaPIP1共定位于ER膜。
通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)響應(yīng)多次處理的TaPIP1的表達(dá)水平。 SA，NaCl和ABA處理使TaPIP1表達(dá)上調(diào)，這意味著TaPIP1可能參與對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)（圖8D）。
圖8. TaBI-1.1和TaPIP1的相互作用和亞細(xì)胞定位
7.TaPIP1增加了擬南芥對(duì)PstDC3000感染的抗性
為了進(jìn)一步研究TaBI-1.1和TaPIP1之間相互作用的潛在功能，研究人員構(gòu)建了一個(gè)在 CaMV 35S啟動(dòng)子控制下表達(dá)TaPIP1的轉(zhuǎn)基因擬南芥。選擇了兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因品系： 35S :: TaPIP1-1和35S :: TaPIP1-2，且TaPIP1的表達(dá)水平較高，這通過(guò)qRT-PCR分析進(jìn)行了驗(yàn)證（圖9A）。鑒于SA處理下TaPIP1水平的上調(diào)，推測(cè)TaPIP1也可能參與對(duì)病原體感染的響應(yīng)。為了驗(yàn)證這個(gè)想法，研究者在Pst DC3000感染下檢測(cè)了TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉表型。在模擬處理下，Col-0和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的葉片中沒(méi)有觀察到差異（圖9B）。在用Pst DC3000接種后，發(fā)現(xiàn)Col-0葉片上明顯的褪綠癥狀，相反，兩種轉(zhuǎn)基因植物的褪綠癥狀較輕（圖9C）。為了進(jìn)一步證實(shí)TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥中的抗性增加，在0和3dpi測(cè)量葉片中的細(xì)菌滴度。如圖9D所示，在初始接種量中Col-0和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系之間沒(méi)有顯著差異，但是在3dpi時(shí)兩個(gè)TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥中的Col-0的細(xì)菌滴度顯著低于Col-0，表明TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥中病原菌的生長(zhǎng)受到很大抑制。因此，TaBI-1.1和TaPIP1在響應(yīng)Pst DC3000感染時(shí)表現(xiàn)出類似的作用，并且研究者推測(cè)TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用可能涉及防御反應(yīng)。
圖9. TaPIP1轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)Pst DC3000表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗性
創(chuàng)新點(diǎn)：
BI-1是一種局限于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜的細(xì)胞保護(hù)蛋白，在對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。迄今為止，雖然已經(jīng)鑒定了幾種與BI-1相互作用的蛋白質(zhì)。然而，關(guān)于BI-1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中機(jī)制的認(rèn)知非常有限，BI-1調(diào)節(jié)植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制目前尚不清楚，該研究中，通過(guò)禾谷鐮刀菌（Fg）處理的小麥的RNA-seq數(shù)據(jù)分析確定了小麥BI-1基因TaBI-1.1，揭示了TaBI-1.1和TaPIP1在響應(yīng)病原體感染的ER膜上的相互作用的可能作用。
參考文獻(xiàn)：
Lu P P, Yu T F, Zheng W J, et al. The Wheat Bax Inhibitor-1 Protein Interacts with an Aquaporin TaPIP1 and Enhances Disease Resistance in Arabidopsis[J]. Front Plant Sci, 2018, 9:20.
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